固定化微生物技术修复PAHs污染土壤的研究进展
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本周的主题为有机污染~
多环芳烃(PAHs)是环境中普遍存在的一类典型有机污染物，绿色修复PAHs污染土壤已成为国内外环境和土壤界共同关注的热点问题之一。作为一种新型的微生物修复技术，固定化微生物修复有机污染土壤正受到越来越多的关注，国内外相关研究刚刚开始。本文重点评述了近几年国内外有关固定化微生物技术修复PAHs污染土壤的最新进展，总结了固定化微生物技术的修复原理、微生物固定化载体的选择、高效降解菌的筛选、固定化方法及影响因素等方面，并提出今后的发展方向，为我国开展固定化微生物技术修复有机污染土壤的研究提供参考。
本文来自《环境科学》2012年第5期。欢迎在留言区表达您的观点，供我们学习，有学术上的意见可以反馈给作者或与其他专家一起讨论。
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作者：钱林波1，2，元妙新1，2，陈宝梁1，2
(1.浙江大学环境科学系，杭州 310058；2.浙江省有机污染过程与控制重点实验室，杭州 310058)
多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是环境中普遍存在的一类重要的持久性有机污染物，其浓度水平与污染特征、环境化学行为与健康效应、污染控制与修复等方面引起了极大关注。PAHs主要是化石燃料和生物质不完全燃烧的产物。土壤PAHs污染来源广泛，包括大气干湿沉降、污水灌溉、化肥及农药施用、秸秆燃烧等。土壤是各种污染物的汇，同时在一定条件下可转变为其它环境介质的二次污染源。PAHs排放量大，具有半挥发性、低溶解性、难生物降解性，常常在土壤中长期存在、大量积累。我国2004年16种PAHs排放量约11.4万t，占全球总排放量的22%，是世界上释放PAHs最多的国家。排放的绝大部分PAHs则沉积在我国境内。自20世纪70年代以来，我国土壤PAHs污染的范围不断扩大、污染日益严重，其浓度水平已从μg·kg－1量级上升到mg·kg－1量级，其检出率从不到20%上升到80%以上。文献将土壤PAHs浓度水平与污染程度划分5种情况:0～200μg·kg－1为无污染、200～600μg·kg－1为轻污染、600～1000μg·kg－1为污染、＞1000μg·kg－1为重污染。据此，我国已报道PAHs浓度水平的土壤中有78%受到PAHs污染，其中32%为重污染。通过土壤-植物系统迁移，PAHs对农产品安全构成严重威胁；经食物链进入人体，进而影响到人类健康。因此，绿色修复土壤PAHs污染已成为国内外环境和土壤界共同关注的热点问题之一。
PAHs污染土壤修复技术主要有化学修复、生物修复(植物修复、微生物修复)、化学-生物相结合的修复等。微生物修复主要指采取强化措施以促进微生物对土壤中有毒有害物质的降解、转化和去除，包括强化土著微生物降解(生物刺激)和投加外源高效降解微生物(生物强化)2种方式。微生物修复是研究最早、最深入、也是应用最广泛的一种生物修复技术，包括原位处理、生物接种、生物堆肥和生物反应器等。作为一种绿色高效的修复技术，固定化微生物修复有机污染土壤正受到越来越多的关注。一方面，固定化微生物具有微生物密度大、反应速度快、耐环境冲击，显著提高修复效率的优点；另一方面固定化微生物技术具有操作简单、要求低、成本低廉的特点。该技术有望克服投加到修复现场中的游离高效降解微生物与土著菌的恶性竞争或难以适应环境的问题，实现高效降解菌有效修复PAHs污染土壤。固定化微生物技术是从固定化酶技术发展起来，始于20世纪60年代，80年代开始兴起发展。固定化微生物技术在废水处理中已有较多报道，但其在土壤修复特别是PAHs污染土壤修复的研究则刚刚开始。在国内，2006年苏丹等提出了用固定化微生物修复受PAHs污染的非流体介质(如土壤)的新技术，论述了其在非流体介质中PAHs污染物原位修复的可行性和需要解决的关键科学问题；也有学者概述了固定化微生物在污染土壤修复中的应用。最近，国际上有关固定化微生物技术修复有机污染土壤逐渐增多。为此，本文从固定化微生物技术的修复原理、微生物固定化载体的选择、高效降解菌的筛选、固定化方法及影响因素等方面，评述了近几年国内外有关固定化微生物技术修复有机污染土壤的最新进展，并探讨了今后的发展方向，以期为我国开展固定化微生物技术修复有机污染土壤的研究提供参考。
1 固定化微生物技术的修复原理
固定化微生物技术主要是指通过物理或化学的方法将分散、游离的微生物固定在某一限定空间区域内，以提高微生物细胞的浓度，使其保持较高的生物活性并反复利用的方法。固定化微生物技术最初主要应用于生物反应器中增加微生物分泌氨基酸、有机酸、抗生素等有用物质或用作生物催化剂。有关固定化微生物技术在废水污染治理中应用受到越来越多的关注，一系列的细菌或真菌被固定于载体材料上用来处理废水中的重金属、营养物质、酚类等污染物。近年来，研究者开始关注应用固定化微生物技术处理海水石油污染、降解环境中PAHs等有机污染物。Lin等利用海藻酸钙凝胶包埋法固定Phanerochaete chrysosporium和粉末活性炭，制得的微生物固定化材料用于降解五氯酚，该复合材料起生物催化剂、污染物吸附富集剂、微生物固态代谢底物等3种作用。
固定化微生物技术在PAHs污染土壤修复中的应用则刚刚开始，其主要的作用原理归纳总结如下:①利用载体材料提供的有利微环境作为缓冲体系，屏蔽土著微生物的竞争作用和不利土壤条件的侵害作用，从而保证接种的高效降解微生物的良好生长；②同时，固定化载体作为吸附剂还可以有效地富集土壤中的PAHs，提高其在载体上的生物有效浓度；③此外，微生物及其分泌的胞外酶也被富集固定在载体上，增加了PAHs与高效降解微生物的接触效率；④富集有高浓度PAHs的微生物固定化材料可成为土著微生物驯化的重要场所，联合外源微生物进一步修复PAHs污染土壤。具体过程见图1所示。因此，固定化载体-微生物构建起了降解PAHs的土壤微环境，大大加快了PAHs的去除。固定化技术不仅大大增加了接种微生物的数量和活性，同时也增加了微生物细胞的稳定性，增强了其耐环境冲击的能力，加快了微生物降解PAHs的反应启动速度，从而增强了微生物去除土壤中PAHs的效率。另外，固定化材料还可以起到疏松剂的作用，加快氧气的输送，因而加速有机污染物的矿化作用。
土壤微生物吸附在土壤有机、无机颗粒上形成生物膜是一种普遍的自然现象，堆肥处理中活性污泥等有机质都携带大量的微生物，对污染物去除有重要的作用。研究表明，固定化技术显著增强微生物的环境适应能力和污染物去除能力，大大提高土壤修复效果，是一项潜在的土壤修复技术。以聚乙烯醇、活性炭、海藻酸钠为固定化载体，采用物理法和化学法包埋固定酵母菌，用于苯并［a］芘污染土壤的修复，结果表明，酵母菌经过混合固定化包埋后，降解效果明显好于游离菌，这是由于固定化载体内部酵母菌密度明显增加所致。同时，微生物作为一种含有多种官能团的蛋白质结构，经固定化后其官能团与载体之间发生共价键或范德华力等作用，主链结构得到加固，不易流失和被破坏，能耐pH变化、有机污染物浓度的变化、生物毒性物质等的冲击，不易失活。用固定化真菌修复芘、苯并［a］芘污染土壤的实验表明，固定化技术显著增强微生物耐环境冲击性，在土壤pH4或9，温度15℃或40℃以及重金属Cd或Pb存在下，对固定化真菌降解芘和苯并［a］芘的影响很小，而游离菌对芘和苯并［a］芘的降解则显著降低，表明固定化对胁迫环境具有屏蔽作用。很多研究表明，微生物固定化可以提高微生物次级代谢产物酶的活性，增强对污染物的去除能力。其主要机制是固定化载体不仅作为微生物附着基质，同时很多载体如植物残体，可以作为固定化微生物生长的介质，促进酶的产生。而在载体内产生的酶吸附在载体中，增加了其与吸附在载体表面有机污染物接触的机会，同时，载体存在的众多孔道，也为酶的传递提供了更多的可能。
目前，有关固定化微生物修复PAHs污染土壤的研究大多集中在灭菌土壤上，而对于非灭菌土壤中投加的外源菌和土著菌对PAHs降解过程中的作用及关系的研究非常少；同时，更多关注模拟PAHs污染土壤的修复效果，而对于实际PAHs污染土壤的修复效果几乎为空白。近年来，研究者对固定化真菌和细菌修复我国东北污灌区PAHs污染土壤进行了一些探索。研究表明，不同的固定化载体和不同的固定化菌影响土壤中PAHs可萃取浓度(生物有效性)和降解率，进而影响土壤中PAHs的修复效果。由于土壤环境本身的非均质和复杂性，固定化微生物技术修复PAHs污染土壤的主要难题在于固定化载体的选择以及适合于土壤修复的优势菌种的筛选，这也成为PAHs污染土壤固定化微生物修复关注的焦点。
2 微生物固定化载体的选择
载体材料的性质是影响固定化微生物活性、稳定性及污染物去除效果的重要因素。虽然不同种类的细菌及同种细菌在不同环境条件下对载体材料的要求都有所区别，但应用于废水处理中的固定化载体一般都具有无毒、带表面官能团、传质效应好、有较大比表面积、具有机械刚性、性能稳定、不溶于水、抗生物分解、寿命长、可重复使用、价格低廉、易获取、易制备等共性。目前废水处理应用中的微生物固定化载体材料主要有无机载体、天然高分子凝胶载体和有机合成高分子凝胶载体、复合载体材料及一些新型载体材料。表1为不同类型载体材料的代表物质以及其优缺点。另外，一些新材料如纳米材料被引进固定化领域，取得不错的效果，为微生物载体选择拓展了新领域。
由于土壤体系的复杂性和独特性，土壤修复对载体材料要求的侧重点与水体不同。土壤原位修复中一般不考虑固定化微生物载体的回收，固定化微生物载体施加进入土壤后即成为土壤中的一部分，因此，土壤修复对载体材料的环境友好性的要求更加严格，尤其需要考虑载体材料对土壤污染物迁移转化行为的影响。另外，载体材料在水体及土壤修复中所承担的功能也是有所区别的。应用于水体的载体材料主要是作为微生物的附着剂，从而提高微生物的稳定性和局部密度，要求载体具有一定的强度和抗微生物分解能力。而土壤修复中的载体材料不仅是微生物的附着剂，同时，载体提供的微环境还是一个良好的缓冲体系，可以屏蔽土壤不利条件的侵害；最重要的是，载体必须为外源微生物提供充足的营养，提高土壤微生物的密度和活性，所以，应用于土壤修复中的载体材料应具有一定的可生物降解性。因此，固定化微生物技术修复污染土壤中，选择合适的载体材料至关重要。
微生物亲和性、吸附能力、被富集污染物的生物有效性是评价固定化载体材料可行性的3个关键参数。现阶段应用于土壤中的固定化材料大多以聚乙烯醇、海藻酸钠和活性炭为主，而对于其它固定化材料的研究则很少。植物残体是一类广泛存在于环境中的天然有机质，是土壤有机质组分的主要来源，含有丰富的C、N等营养元素，对微生物和酶都具有很强的亲和性；植物残体腐殖化过程向土壤释放的各种溶解性有机质，其中很多是高环PAHs降解的共代谢底。向土壤添加植物残体材料等天然有机质可明显改善土壤理化性质，促进土壤微生物活性和数量，增强PAHs去除，是一种潜在的固定化载体材料。用甘蔗渣、木屑、麦秆等常见的植物残体固定微生物，可实现较高的酶产量和污染物去除能力。近年来，利用植物残体类天然有机质固定微生物去除水中PAHs等有机污染物已见报道，Gentili等用壳质角素和壳聚糖作为载体材料固定红球菌属(Rhodococcus corynebacterioides)修复原油污染海水，发现固定化细菌对海水污染物的去除比游离菌提高了大约30%。用甘蔗渣固定白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)大大提高了锰过氧化酶的活性和水体蒽的去除率。此外，稻秆、松针粉］等都被证明是有效的固定化载体材料。有关利用天然有机质材料固定微生物修复PAHs污染土壤的报道较少，但天然有机质的潜在优势，如可以作为PAHs的天然生物吸附剂。Su等用玉米棒吸附固定真菌(Mucor sp.)修复苯并［a］芘污染土壤，发现固定化菌对环境适应能力更强、反应启动速度更快，苯并［a］芘去除效果更好。不同化学组成的植物材料对微生物降解PAHs有不同的影响，Dzul-Puc等分别以甘蔗渣和松针粉末作为黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)的生长基质，并用于苯并［a］芘污染土壤的修复，结果发现，甘蔗渣组苯并［a］芘降解更快。采用植物残体固定细菌修复PAHs污染土壤，结果表明植物残体及其提取液可强化固定化菌和土著微生物去除PAHs。
固定化微生物技术修复PAHs污染土壤的效果取决于降解菌与污染物的可接触性。微生物固定化技术明显提高局部土壤微生物的密度和活性，但同时限制微生物向固定化颗粒外部发展，由于土壤中PAHs等有机污染物迁移能力较弱，所以往往只有与固定化微生物接触的土壤得到有效修复。因此，为保证修复效果，必须经常翻耕土壤，并多次投加固定化微生物，造成修复成本增加、处理难度加大，严重限制其实际应用。一些高吸附性能的吸附剂可被用作固定化载体材料以解决上述缺陷。高吸附性能材料可促进PAHs由土壤有机质向固定化载体迁移，使固定化载体同时富集高浓度的微生物和土壤中的PAHs，增加PAHs与微生物的接触，实现PAHs的富集-降解一体化，从而显著促进土壤修复效果。一些研究者用活性炭固定微生物并用于环境污染修复，取得较好的效果。但活性炭生产成本较高，其环境影响也有待进一步研究。笔者所在课题组率先利用环境友好材料生物碳作为固定化基材，开展了固定化微生物修复PAHs污染土壤。生物碳是一类由天然生物质限氧裂解产生的富炭质材料，在自然界中广泛存在，具有很大的比表面积，对PAHs等有机污染物有很强的吸附能力，能大量富集污染物，促使污染物由土壤向生物碳迁移，从而提高微生物与污染物接触的几率。另外，生物碳是一类环境友好的材料，富含C、N等营养元素，表面携带大量官能团，能显著改善土壤理化条件，其多孔性质有利于微生物的附着生长。利用生物碳固定微生物在农业中已有广泛应用，关于其在土壤修复方面的应用有待深入研究。
载体材料对PAHs的吸附作用及吸附态PAHs的生物有效性是影响固定化微生物对污染土壤修复效果的重要因素。植物残体等天然有机质对PAHs吸附主要以分配作用为主，脂肪碳和芳香碳是其吸附的主要组分。相比天然有机质，生物碳对PAHs的吸附能力更强，吸附行为由表面吸附和分配作用所控制。生物碳制备条件尤其是裂解温度对其吸附性能有重要的影响。一般认为，随制备温度的增加，生物碳吸附能力逐渐增强，表面吸附作用贡献增大，被吸附的PAHs生物有效性降低。吸附作用导致土壤PAHs向载体迁移、富集，明显改变其迁移、转化行为和生物有效性。传统的研究认为微生物不能直接利用颗粒吸附态的有机污染物，污染物必须首先从吸附颗粒上脱附下来进入土壤溶液才能被微生物降解，所以，吸附作用实际上降低了土壤污染物的生物有效性，使土壤成为有机污染物重要的储存库。但也有研究认为，微生物可以直接利用颗粒吸附态的污染物，利用效率主要与颗粒的表面结构、化学性质及碳结构与微生物亲和性有关。Yang等研究了土壤有机质对菲吸附作用和降解行为的影响。他们发现随着土壤有机碳含量的增加(0.23%→7.1%)，土壤溶解性菲含量急剧下降［(28.63±2。15)μ
g·L－1→(0.79±0.04)μg·L－1］。但接种细菌(Mycobacterium vanbaalenii PYR-1)培养216h后，不同有机碳含量土壤中菲降解量并无显著变化，且土壤菲残留量都明显的低于模型预测值(模型认为微生物只能利用溶解态PAHs)，说明吸附态PAHs可以被微生物直接摄取利用。有研究认为微生物主要先利用土壤溶液中的PAHs，然后对吸附态PAHs进行降解，其降解效率主要与土壤有机碳含量和土壤孔隙率有关。对木质素、蜡质、纤维素吸附态菲的细菌降解实验发现，培养30d后，蜡质吸附态菲和纤维素吸附态菲分别被降解49.6%±0.6%和54.7%±3.4%，大大高于19.7%和39.0%的模型预测效果，说明大约有30%的蜡质吸附态菲和15%的纤维素吸附态菲是通过微生物直接摄取被降解的；实验中只有1.2%±0.2%的木质素吸附态菲被降解，说明木质素的吸附作用显著的降低了PAHs的生物有效性。微生物在有机质表面附着生长是其利用吸附态污染物的关键步骤，蜡质疏水表面对微生物的强亲和性是蜡质吸附态菲生物有效性较高的主要原因。因此，在固定化微生物修复PAHs污染土壤时，表面蜡质含量或疏水性等参数是选择载体材料的重要依据。
3 固定化微生物及高效降解菌的筛选
固定化微生物修复技术是载体与微生物共同作用的结果，微生物性质对土壤修复效果有重要的影响。用于PAHs污染土壤修复的微生物包括土著菌、外来高效菌和基因工程菌。表2列出了固定化微生物、固定化载体、固定化方法及其对PAHs污染土壤的修复效果的影响。不同的微生物固定化后对PAHs的降解存在很大的差异性。从表2可见，在细菌、真菌以及它们种内和种间联合作用条件下(以PAHs典型代表物芘为例)，单细菌对土壤中芘的去除率较差，最佳的降解菌种是动胶杆菌(Zoogloea sp.)9号，去除率为52.7%；单真菌对芘的去除效果普遍高于单细菌，最佳的降解菌种是镰刀菌(Fusarium sp.)，去除率达到了69%。单种微生物对PAHs表现出一定的降解能力，但众多研究表明，菌种的种内联合或种间联合降解往往优于单个菌种的降解能力。对2种细菌芽孢杆菌(Bacillus sp.)2号和动胶杆菌(Zoogloea sp.)9号联合降解芘研究表明，两菌联合降解的效果好于单菌种，对芘的降解率为61.8%；而2种真菌的联合降解效果更好，黑曲霉和镰刀菌在对初始浓度为100mg·kg－1芘的降解率达到了81%。由此可见，在固定化微生物修复PAHs污染土壤中，联合菌种降解能力高于单个菌种；而在单菌种对PAHs的降解中，真菌的降解能力普遍高于细菌。然而，大部分研究结果是在土壤灭菌条件下获得的，与现实不灭菌的土壤条件有差别。最近有学者研究了固定化微生物投加到不灭菌的PAHs污染土壤中的修复效果，结果表明，加入松针生物碳固定化菌后，东北污灌区污染土壤中16种PAHs的可萃取浓度和可萃取率均显著降低，并且随着生物碳炭化温度升高而降低；生物碳固定化菌可以降解吸附的PAHs，筛选的高效土著菌能有效的利用生物碳固定化菌吸附的PAHs。由此可见，相对于外源菌，筛选的土著高效菌对PAHs的降解具有天然的优势。因此，筛选具有高降解性能的土著菌用于固定化微生物修复PAHs污染土壤是一种环境友好的选择。
固定化微生物能否有效利用载体吸附态PAHs是修复成功的关键因素。微生物在载体表面附着生长可增加微生物与吸附态PAHs的接触机会，从而促进微生物对PAHs的降解作用。研究表明，具疏水性表面的微生物更容易附着在各类载体材料的表面，故而可能是一种更加有利的选择。直接用吸附态PAHs来筛选、驯化微生物，可望得到能高效利用吸附态PAHs的菌种，对微生物固定化技术的成功应用有重大意义，以解决溶液驯化高效菌在固定时难以达到同样降解效果的难题。Bastiaens等将过量的PAHs加入无机盐培养基中筛选获得分支鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)，同时将PAHs吸附在一种疏水性材料膜上作为碳源筛选得到分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)，结果发现分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)具有更强的疏水性，更易在各种不同材料表面附着生长。Vacca等分别用溶液态菲和腐殖酸吸附态菲筛选获得菲降解菌，发现只有通过吸附态菲筛选获得的微生物具有直接矿化颗粒吸附态菲的能力。不同材料吸附态PAHs作为碳源可筛选得到不同种类的微生物，Friedrich等用聚丙烯树脂吸附态菲筛选得到分枝杆菌属(Mycobacterium)，而用安伯来特树脂吸附态菲却得到洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)，说明不同微生物对不同载体吸附态PAHs有不同的生物有效性。有关筛选、驯化高效微生物大多局限在液体环境下，驯化的环境与吸附态PAHs的降解环境条件相反，增加了微生物适应的时间，减慢了固定化微生物的反应速度。而采用高吸附性能材料富集PAHs作为碳源筛选得到菌种，使微生物从一开始就处于“工作”的环境，减少了微生物反应时间，经过“热身”的微生物，为更快地投入降解修复打下基础。因此，利用强吸附能力的材料富集PAHs作为碳源筛选菌种是固定化微生物研究的重要突破方向。
固定化微生物另一个来源是引进外来微生物，外来微生物是强化多环芳烃污染土壤修复的重要手段，特别是在自然条件下，固定化外来微生物可以加快污染物的去除。研究结果表明，在自然土壤中加入初始浓度为100mg·kg－1的芘、苯并［a］芘，培养10d后，固定化单菌添加组对芘、苯并［a］芘去除率分别为49%～69%、29%～37%，明显高于游离菌添加组；固定化混合菌添加组对芘、苯并［a］芘去除率更是高达81%和43%。作为PAHs的高效降解菌种，固定化黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)修复PAHs污染土壤引起了研究者的广泛关注。研究表明，用甘蔗渣固定黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)大大提高了锰过氧化酶的活性和水体蒽的去除率。Dzul-Puc等分别以甘蔗渣和松针粉末作为黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)的生长基质，用于苯并［a］芘污染土壤的修复，结果发现，加入甘蔗渣和松针粉末都可以促进土壤中苯并［a］芘的去除，其最大去除率(BaP/干土)分别为50.12mg·kg－1和39.94mg·kg－1。
4 微生物固定化方法及其它影响因素
固定化载体和高效降解菌是固定化微生物技术的2个重要支撑，而固定化方式是协调2个支撑的关键媒介。固定化方式可以极大地影响微生物的生长和代谢，进而影响修复效果。主要的固定化方式有吸附法、包埋法、交联法、共价结合法，微生物自身固定化以及组合固定化技术等。表3中列出了各种固定化方法的性能比较。交联法虽然结合牢固，稳定性好，但操作比较复杂，反应条件激烈，容易导致微生物失活，故不常使用。吸附法和包埋法是应用最广泛的固定化方法。吸附法操作简单，对细胞活性影响小，但固定微生物数量和强度受载体影响大，且效果不稳定。包埋法可以实现高浓度的微生物固定，且微生物与载体联结强度较高，但包埋过程剪切力会导致微生物细胞失活。在固定化微生物修复PAHs污染土壤中，研究者大多采用吸附法和包埋法。
有学者分别用物理法和化学法包埋固定酵母菌修复苯并［a］芘污染土壤，结果表明，物理法效果普遍优于化学法，物理包埋法苯并［a］芘半衰期为5.66～8.49d，化学法为6.56～9.32d，比游离菌组有不同程度降低(7.40～12.03d)。为克服单一固定化技术的缺陷，组合固定化技术被关注。吸附-包埋联合固定化技术是一种重要的组合固定技术，首先将微生物与载体材料充分混合，使微生物尽可能的附着在载体材料上，然后用海藻酸钠等凝胶剂将混合液包埋固定。吸附-包埋联合固定化技术不仅实现高浓度的微生物固定和较高的固定化强度，同时由于吸附过程载体材料提供的微环境和营养物质，很好地解决了包埋过程微生物失活的问题。
除了固定化方法对固定化微生物性能有影响之外，固定化过程中各种条件参数也影响其环境修复效果。固定化时间和载体用量是固定化过程中2个重要的参数，对固定化颗粒韧性、微生物活性、微生物与载体结合强度都有显著的影响。荚荣等研究发现，固定化时间是影响固定化白腐真菌F17对多种染料降解效果的主要因素，菌丝与载体结合2d，白腐真菌对染料金橙G和刚果红具有最佳脱色率。Tao等比较了海藻酸钠浓度对包埋固定化效果的影响，发现在3%海藻酸钠添加浓度下得到的固定化细菌(Sphingomonas)颗粒在塑形、强度、韧性、通透性等方面均有较好的表现。
5 结论与展望
固定化微生物技术以其独特的优势和巨大的应用潜力在废水处理领域得到了广泛应用。但其在土壤修复中的研究则刚刚起步，其实用化倾向即大规模实际应用特征非常明显。要实现其规模化应用还有许多问题急需解决:①获得适宜于土壤的固定化载体，应用于土壤修复的微生物固定化载体应具有环境友好、性能稳定、成本低廉、微生物亲和性好、污染物吸附能力强的特点；植物残体类的天然有机质、生物碳类的炭质材料以及农业有机废弃物等具有明显的优势，是潜在的载体选择。②高效降解菌的筛选，采用疏水性表面的微生物更容易附着在各类载体材料的表面，直接用吸附态PAHs来筛选、驯化微生物，可望得到能高效利用吸附态PAHs的菌种或菌群。因此，利用吸附态PAHs作为碳源筛选获得能直接降解吸附态PAHs的高效降解菌是微生物固定化技术成功应用于土壤修复的另一个突破口。③采用合适的固定化方法，固定化方法应实现固定化微生物的高浓度、高活性、与载体结合强度高、性能稳定以及增强吸附固定作用等要求。吸附法和包埋法是应用广泛的固定化方法，但都存在一定的缺陷，吸附-包埋联合固定化技术可能是未来的一个重要选择。④固定化微生物的稳定性、持久性、安全性还有待进一步研究，同时，固定化微生物施入土壤后的激活以及调控机制还需要更多的探索。⑤与其他修复技术的联合使用，如用表面活性剂促进PAHs从土壤有机质中解吸出来，增加其流动性，提高其生生物可利用性。
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